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Forschungsprojekte

 

Mutationsanalysen, Promotoranalysen und funktionelle Studien an Kandidatengenen für Morbus Parkinson

  • Mutationsanalyse Synphilin-1:
    Synphilin-1 ist als Interaktionspartner von a-Synuclein (PARK1) und Parkin (PARK2) mit der Pathogenese von Morbus Parkinson verknüpft. Darüber hinaus ist Synphilin-1 ein Bestandteil der Lewy-Körper in den Gehirnen von Patienten mit sporadischem Morbus Parkinson. Deshalb haben wir eine detaillierte Mutationsanalyse des Synphilin-1 Gens in 328 deutschen Parkinson Patienten mit familiärem und sporadischem Morbus Parkinson durchgeführt. In zwei Parkinson-Patienten wurde eine neue C>T Transition an Position 1861 der codierenden Sequenz identifiziert, die zu einem Aminosäureaustausch von Arginin nach Cystein an Position 621 führt (R621>C). Diese Mutation wurde in keiner der 351 gesunden Kontrollpersonen gefunden. Um eine mögliche Rolle von mutiertem Synphilin-1 an der Pathogenese von Morbus Parkinson zu untersuchen, haben wir funktionelle Analysen in SH-SY5Y Zellen durchgeführt. Dabei hat sich herausgestellt, dass Synphilin-1 in transfektierten Zellen cytoplasmatische Einschlüsse bildet. Dabei wurden bei Hemmung von Proteasomen signifikant weniger Einschlüsse in C621 Synphilin-1 exprimierenden als in Wildtyp-Synphilin-1 exprimierenden Zellen beobachtet. Mit C621 Synphilin-1 transfektierte Zellen waren darüber hinaus mehr anfällig gegenüber Staurosporin-induziertem Zelltod. Diese Ergebnisse sprechen für eine kausale Rolle der R621>C Mutation im Synphilin-1 Gen beim Morbus Parkinson und impliziert, dass die Entstehung intrazellulärer Einschlüsse positive Effekte für Zellen hat. Die Mutation in Synphilin-1 reduziert die Aggregatikonsfähigkeit und könnte Neurone anfälliger gegenüber zellulären Stress machen.

  • α-Synuclein Promotor:
    Mutationen im a-Synuclein Gen haben sich in einigen Familien als verantwortlich für autosomal dominant vererbten Morbus Parkinson erwiesen. Außerdem ist a-Synuclein eine Hauptkomponente der Lewy Körper in der sporadischen Form von Morbus Parkinson. Erhöhte Konzentrationen von Wildtyp a-Synuclein führen zu erhöhten intrazellulären Wasserstoffperoxid-Konzentrationen und verursachen den Untergang dopaminerger Neurone in Ratten-Primärkulturen. Nachfolgend wurde in vitro ein direkter Zusammenhang von oxidativem Stress mit a-Synuclein-Aggregation nachgewiesen. Es stellt sich also die Frage, ob eine erhöhte Expression von a-Synuclein auch ein erhöhtes Erkrankungsrisiko für Morbus Parkinson bewirkt und ob Promotorpolymorphismen im a-Synuclein Gen mit Morbus Parkinson assoziiert sind. Wir haben zwei Polymorphismen des a-Synuclein Promotors (-116C>G and -668T>C) in 315 deutschen Parkinson-Patienten charakterisiert. Der Einfluss der 4 Haplotypen auf die Genexpression wurde mittels CAT-Reportergenanalysen in neuronalen SK-N-AS Zellen untersucht. Der -668C/-116G Haplotyp ergab eine signifikant höhere CAT-Expression als der 668T/-116G oder der -668T/-116C Haplotyp. In Parkinson-Patienten kommt der -668C/-116G Haplotyp häufiger als die übrigen Haplotypen, jedoch war dieser Unterschied nicht signifikant.

  • Mutationsanalyse NF-L:
    Mutationen in zwei Genen, a-Synuclein (SNCA) und Parkin, wurden als Ursache in einigen Fällen familiärer der Parkinsonschen Erkrankung identifiziert. Nachfolgend wurden a-Synuclein und Parkin in Lewy-Körpern nachgewiesen. Um weitere Einblicke in die Pathogenese der Morbus Parkinson zu erhalten, wurde die Beteiligung des Neurofilament Light-Gens (NF-L) in deutschen Patienten mit Morbus Parkinson untersucht. NF-L ist ebenfalls eine Komponente der Lewy-Körper. Eine detaillierte Mutationssuche in 328 sporadischen und familiären deutschen Parkinson-Patienten ergab drei stille Basenaustausche (G163A, C224T, C487T) in drei unverwandten Patienten. Die Analyse der Promotorregion des NF-L Gens lieferte drei Basenpaaraustausche, die 5 Haplotypen bilden. Assoziationsstudien dieser Haplotypen ergaben keine signifikanten Unterschiede zwischen Parkinson-Patienten und 344 Kontrollindividuen. Deshalb ist NF-L wahrscheinlich nicht hauptsächlich an der Pathogenese von Morbus Parkinson beteiligt.

  • Mutationsanalyse 14-3-3 eta:
    Mutationen im a-Synuclein Gen wurden in einigen Familien mit autosomal dominantem Morbus Parkinson identifiziert. a-Synuclein besitzt strukturelle und funktionelle Homologien zu 14-3-3 Proteinen und bindet sowohl 14-3-3 Proteine als auch deren Liganden. Deshalb wurde untersucht, ob 14-3-3 Proteine ebenfalls an der Pathogenese von Morbus Parkinson beteiligt sind. Wir konnten zeigen, dass 14-3-3 Proteine ebenfalls Bestandteil der Lewy-Körper sind. Das 14-3-3 eta Gen (YWHAH) liegt auf Chromosom 22q12.1-q13.1, eine Region, die mit Morbus Parkinson in Verbindung gebracht wurde. Deshalb wurde 14-3-3 eta mittels Mutationsanalysen und Assoziationsstudien untersucht. In 358 sporadischen und familiären Parkinson Patienten wurden jedoch keine krankheitsverursachenden Mutationen identifiziert. Außerdem lieferten Assoziationsstudien mit intragenischen Polymorphismen keine Beweise für eine Beteiligung von 14-3-3 eta an der Pathogenese von Morbus Parkinson.

  • Mutationsanalyse 14-3-3 zeta:
    14-3-3 Proteine sind an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt, darunter auch die neuronale Entwicklung und die zelluläre Wachstumskontrolle. 14-3-3 Proteine sind besonders stark im Gehirn konzentriert, wo sie ca. 1% der löslichen Proteine ausmachen. Sie wurden sowohl in den neurofibrillären Tangles von Alzheimer-Patienten als auch in den Lewy Körpern von Parkinson-Patienten nachgewiesen. Als Kinase-abhängige Aktivatoren der Tyrosin- und Tryptophan Hydroxylasen sind sie an der Synthese und Exkretion von Bioaminen wie Dopamin beteiligt. Kürzlich wurde gezeigt, dass a-Synuclein strukturelle und funktionelle Homologien zu 14-3-3 Proteinen besitzt und sowohl 14-3-3 Proteine als auch deren Liganden bindet. Im a-Synuclein Gen wurden bei einigen Familien mit autosomal dominant vererbten Morbus Parkinson Mutationen identifiziert. Deshalb haben wir untersucht, ob 14-3-3 Proteine ebenfalls an der Pathogenese von Morbus Parkinson beteiligt sind. Wir haben dazu mittels SSCP-Analyse nach Mutationen im 14-3-3 zeta Gen (YWHAZ) auf Chr. 8q23.1 und zwei homologen Genen auf den Chromosomen 10p12.33 (XM_005100) and Xp11.4 (XM_018019.2) gesucht. In 460 sporadischen und familiären deutschen Parkinson-Patienten wurde keine Mutation im 14-3-3 zeta Gen identifiziert, aber die Analyse des homologen Gens auf Chromosom X ergab in einem Patienten eine A95>G Transition, die zu einem Gln32>Arg Austausch führt. Da keine Familienmitglieder verfügbar sind, sind funktionelle Analysen notwendig, um die Bedeutung dieser Mutation bei der Pathogenese von Morbus Parkinson zu untersuchen. In einem weiteren Patienten wurde eine 1 bp Deletion (98delG) im homologen Gen auf Chr. 10 identifiziert. Eine Tochter des Indexpatienten trägt ebenfalls diese Mutation, hat aber das Erkrankungsalter des Indexpatienten noch nicht erreicht, so dass auch für diese Mutation funktionelle Analysen notwendig sind. Beide Mutationen wurden in keiner von 364 Kontrollpersonen gefunden.

Tiermodelle neurodegenerativer Erkrankungen

  • Morbus Huntington ist eine neurodegenerative CAG-Trinukleotidexpansionserkrankung des Menschen. Wir haben ein transgenes Rattenmodell entwickelt, das ein verkürztes Huntingtin-Gen mit 51 CAG-Wiederholungseinheiten unter der Kontrolle des nativen Huntingtin-Promotors der Ratte exprimiert. Wie bei der humanen Erkrankung beginnt der neurologische Phänotyp bei adulten Ratten und schreitet langsam fort. Die Tiere zeigen Symptome wie reduziertes Angstverhalten, kognitive Beeinträchtigungen, fortschreitende motorische Fehlfunktionen und die typischen histopathologischen Veränderungen im Gehirn. Wie bei den Morbus Huntington Patienten, zeigten in vivo bildgebende Verfahren eine Schrumpfung des Striatums (MRT) und einen reduzierten Zuckerstoffwechsel (hochauflösende Fluor-deoxy-Glucose PET). Dies ist das erste Ratten-Modell einer neurodegenerativen Erkrankung, das eine intermediäre Zahl an CAG-Wiederholungen exprimiert. Das Modell erlaubt ausgedehnte in vivo bildgebende Untersuchungen und ist deshalb ideal für die Evaluierung neuer therapeutischer Ansätze für Morbus Huntington.

  • konditionell transgene Mäuse, die über das Tet-Off-System die konditionelle Expression des SCA3-Gens erlauben und somit ein induzierbares Modell für die Machado-Joseph-Erkrankung (bzw. Spinocerebellare Ataxie Typ 3) bilden. Das Modell wurde bereits auf internationalen Tagungen vorgestellt und wird gegenwärtig charakterisiert.

  • konditionell transgene Mäuse, die über das Tet-Off-System die konditionelle Expression des α-Synuclein-Gens (WT und Ala30Pro) ermöglichen und somit ein induzierbares Modell für den Morbus Parkinson bilden. Das Modell wurde bereits auf internationalen Tagungen präsentiert und auf dem 3. Deutschen Parkinson-Kongress in Dresden mit einem Posterpreis ausgezeichnet.

Onkogenetik

  • Untersuchung uteriner Leiomyme auf genetische Veränderungen mit Hilfe von CNV-Arrays (Affymetrix CytoScan HD und Affymetrix Oncoscan) zur Ursachenforschung und zur Beurteilung des malignen Potentials.

Förderung

durch die Medizinische Fakultät der Universität Rostock:

  • Forun 2000: Anschubförderung "Bedeutung von Sequenzvarianten des α-Synuclein Promotors bei der Pathogenese des Morbus Parkinson"
    19.800,- DM Sachmittel (Geräte und Verbrauchsmaterial)
  • Forun 2001: Verlängerung der Anschubförderung "Bedeutung von Sequenzvarianten des α-Synuclein Promotors bei der Pathogenese des Morbus Parkinson"
    10.000,- DM Sachmittel (Verbrauchsmaterial)
  • Forun 2002-2003: Anschubförderung "Bedeutung von Sequenzvarianten von 14-3-3 Proteinen bei der Pathogenese des Morbus Parkinson"
    15.000,- EUR Sachmittel (Geräte und Verbrauchsmaterial) für 2002
    10.000,- EUR Sachmittel (Verbrauchsmaterial) für 2003
  • Forun 2007: Projektförderung "Transgenes Rattenmodell für Morbus Huntington: striatale Transplantation von humanen CNTF oder CIP-4 exprimierenden neuronalen Progenitorzellen"
    30.000,- EUR Fördervolumen (Geräte und Verbrauchsmaterial)
  • Forun 2008-2009 Projektförderung "Untersuchung des Zusammenhangs von Proteolyse und Pathogenese beim transgenen Rattenmodell für Morbus Huntington"
    44.730,- EUR Fördervolumen (Personalmittel und Verbrauchsmaterial)

Publikationsliste

  • Thiele K, Holzmann C, Solano ME, Zahner G, Arck PC. Comparative sensitivity analyses of quantitative polymerase chain reaction and flow cytometry in detecting cellular microchimerism in murine tissues. J Immunol Methods. 2014 Mar 20;PubMed PMID: 24657636.
  • Holzmann C, Markowski DN, Koczan D, Helmke BM, Bullerdiek J. Genome-wide acquired uniparental disomy as well as chromosomal gains and losses in an uterine epithelioid leiomyoma. Mol Cytogenet. 2014 Mar 3;7(1):19. PubMed PMID: 24593849.
  • Hovakimyan M, Maass F, Petersen J, Holzmann C, Witt M, Lukas J, Frech MJ, Hübner R, Rolfs A, Wree A. Combined therapy with cyclodextrin/allopregnanolone and miglustat improves motor but not cognitive functions in Niemann-Pick Type C1 mice. Neuroscience. 2013 Nov 12;252:201-11. PubMed PMID: 23948640.
  • Holzmann C, Bauer I, Meyer P. Co-occurrence of multiple sclerosis and cancer in a BRCA1 positive family. Eur J Med Genet. 2013 Oct;56(10):577-9. PubMed PMID: 23954390.
  • Kljajevic V, Meyer P, Holzmann C, Dyrba M, Kasper E, Bokde AL, Fellgiebel A, Meindl T, Hampel H, Teipel S, EDSD study group. The ε4 genotype of apolipoprotein E and white matter integrity in Alzheimer's disease. Alzheimers Dement. 2013 May 21;PubMed PMID: 23706516.
  • Kuhla A, Lange S, Holzmann C, Maass F, Petersen J, Vollmar B, Wree A. Lifelong caloric restriction increases working memory in mice. PLoS One. 2013;8(7):e68778. PubMed PMID: 23874758; PubMed Central PMCID: PMC3707851.
  • Holzmann, C., Draeger, D., Mix, E., Hawlitschka, A., Benecke, R., Wree, A. Effects of intrastriatal botulinum neurotoxin A on the behavior of Wistar rats. Behav Brain Res. 2012 Sep 1;234(1):107-16. PubMed PMID: 22728288.
  • Boy J, Schmidt T, Schumann U, Grasshoff U, Unser S, Holzmann C, Schmitt I, Karl T, Laccone F, Wolburg H, Ibrahim S, Riess O. A transgenic mouse model of spinocerebellar ataxia type 3 resembling late disease onset and gender-specific instability of CAG repeats. Neurobiol Dis. 2010 Feb; 37 (2) :284-93. PubMed PMID:19699305.
  • Boy J, Schmidt T, Wolburg H, Mack A, Nuber S, Böttcher M, Schmitt I, Holzmann C, Zimmermann F, Servadio A, Riess O. Reversibility of symptoms in a conditional mouse model of spinocerebellar ataxia type 3. Hum Mol Genet. 2009 Nov 15; 18 (22) :4282-95. PubMed PMID:19666958.
  • Nguyen HP, Metzger S, Holzmann C, Koczan D, Thiesen HJ, von Hörsten S, Riess O, Bonin M. Age-dependent gene expression profile and protein expression in a transgenic rat model of Huntington's disease. Proteomics Clin Appl. 2008 Dec; 2 (12) :1638-50. PubMed PMID:21136814.
  • Nuber S, Petrasch-Parwez E, Winner B, Winkler J, von Hörsten S, Schmidt T, Boy J, Kuhn M, Nguyen HP, Teismann P, Schulz JB, Neumann M, Pichler BJ, Reischl G, Holzmann C, Schmitt I, Bornemann A, Kuhn W, Zimmermann F, Servadio A, Riess O. Neurodegeneration and motor dysfunction in a conditional model of Parkinson's disease. J Neurosci. 2008 Mar 5; 28 (10) :2471-84. PubMed PMID:18322092.
  • Nguyen HP, Kobbe P, Rahne H, Wörpel T, Jäger B, Stephan M, Pabst R, Holzmann C, Riess O, Korr H, Kántor O, Petrasch-Parwez E, Wetzel R, Osmand A, von Hörsten S. Behavioral abnormalities precede neuropathological markers in rats transgenic for Huntington's disease. Hum Mol Genet. 2006 Nov 1; 15 (21) :3177-94. PubMed PMID:16984963.
  • Boy J, Leergaard TB, Schmidt T, Odeh F, Bichelmeier U, Nuber S, Holzmann C, Wree A, Prusiner SB, Bujard H, Riess O, Bjaalie JG. Expression mapping of tetracycline-responsive prion protein promoter: digital atlasing for generating cell-specific disease models. Neuroimage. 2006 Nov 1; 33 (2) :449-62. PubMed PMID:16931059.
  • Kántor O, Temel Y, Holzmann C, Raber K, Nguyen HP, Cao C, Türkoglu HO, Rutten BP, Visser-Vandewalle V, Steinbusch HW, Blokland A, Korr H, Riess O, von Hörsten S, Schmitz C. Selective striatal neuron loss and alterations in behavior correlate with impaired striatal function in Huntington's disease transgenic rats. Neurobiol Dis. 2006 Jun; 22 (3) :538-47. PubMed PMID:16480885.
  • Bauer A, Zilles K, Matusch A, Holzmann C, Riess O, von Hörsten S. Regional and subtype selective changes of neurotransmitter receptor density in a rat transgenic for the Huntington's disease mutation. J Neurochem. 2005 Aug; 94 (3) :639-50. PubMed PMID:16033418.
  • Hering R, Petrovic S, Mietz EM, Holzmann C, Berg D, Bauer P, Woitalla D, Müller T, Berger K, Krüger R, Riess O. Extended mutation analysis and association studies of Nurr1 (NR4A2) in Parkinson disease. Neurology. 2004 Apr 13; 62 (7) :1231-2. PubMed PMID:15079038.
  • Berg D, Holzmann C, Riess O. 14-3-3 proteins in the nervous system. Nat Rev Neurosci. 2003 Sep; 4 (9) :752-62. PubMed PMID:12951567.
  • Marx FP, Holzmann C, Strauss KM, Li L, Eberhardt O, Gerhardt E, Cookson MR, Hernandez D, Farrer MJ, Kachergus J, Engelender S, Ross CA, Berger K, Schöls L, Schulz JB, Riess O, Krüger R. Identification and functional characterization of a novel R621C mutation in the synphilin-1 gene in Parkinson's disease. Hum Mol Genet. 2003 Jun 1; 12 (11) :1223-31. PubMed PMID:12761037.
  • von Hörsten S, Schmitt I, Nguyen HP, Holzmann C, Schmidt T, Walther T, Bader M, Pabst R, Kobbe P, Krotova J, Stiller D, Kask A, Vaarmann A, Rathke-Hartlieb S, Schulz JB, Grasshoff U, Bauer I, Vieira-Saecker AM, Paul M, Jones L, Lindenberg KS, Landwehrmeyer B, Bauer A, Li XJ, Riess O. Transgenic rat model of Huntington's disease. Hum Mol Genet. 2003 Mar 15; 12 (6) :617-24. PubMed PMID:12620967.
  • Holzmann C, Krüger R, Saecker AM, Schmitt I, Schöls L, Berger K, Riess O. Polymorphisms of the alpha-synuclein promoter: expression analyses and association studies in Parkinson's disease. J Neural Transm. 2003 Jan; 110 (1) :67-76. PubMed PMID:12541013.
  • Ubl A, Berg D, Holzmann C, Krüger R, Berger K, Arzberger T, Bornemann A, Riess O. 14-3-3 protein is a component of Lewy bodies in Parkinson's disease-mutation analysis and association studies of 14-3-3 eta. Brain Res Mol Brain Res. 2002 Dec; 108 (1-2) :33-9. PubMed PMID:12480176.
  • Rahner N, Holzmann C, Krüger R, Schöls L, Berger K, Riess O. Neurofilament L gene is not a genetic factor of sporadic and familial Parkinson's disease. Brain Res. 2002 Sep 27; 951 (1) :82-6. PubMed PMID:12231460.
  • Holzmann C, Schmidt T, Thiel G, Epplen JT, Riess O. Functional characterization of the human Huntington's disease gene promoter. Brain Res Mol Brain Res. 2001 Aug 15; 92 (1-2) :85-97. PubMed PMID:11483245.
  • Holzmann C, Mäueler W, Petersohn D, Schmidt T, Thiel G, Epplen JT, Riess O. Isolation and characterization of the rat huntingtin promoter. Biochem J. 1998 Nov 15; 336 ( Pt 1):227-34. PubMed PMID:9806905; PubMed Central PMCID: PMC1219862.
  • Holzmann C, Saecker AM, Epplen JT, Riess O. Avoiding errors in the diagnosis of (CAG)n expansion in the huntingtin gene. J Med Genet. 1997 Mar; 34 (3) :264. PubMed PMID:9132504; PubMed Central PMCID: PMC1050907.