Diplom-Biologe  
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Dissertation an der Ruhr-Universität Bochum

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Tel 0241/87 34 34

Die Deutsche Bibliothek - CIP-Einheitsaufnahme

Holzmann, Carsten:
Isolierung und Charakterisierung des Promotors des
Huntingtin-Gens / Carsten Holzmann. - Aachen : Mainz, 1998
zugl.: Bochum, Ruhr-Univ., Diss. 1998


ISBN 3-89653-353-3


Für weitere Informationen über Morbus Huntington empfehle ich die Homepage der Deutschen Huntington Hilfe e.V.


Inhaltsverzeichnis:

1 Einleitung

    1.1 Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen

    1.2 Morbus Huntington

      1.2.1 Pathologie

      1.2.2 Genetik

      1.2.3 Expression und intrazelluläre Lokalisation des Huntingtin-Proteins

      1.2.4 Molekulare Mechanismen der Krankheitsentstehung

      1.2.5 Wechselwirkungen mit anderen Proteinen

      1.2.6 Tiermodelle

    1.3 Eukaryotische Promotoren und Genexpression

2 Zielsetzung der Arbeit

3 Material und Methoden

3.1 Material

3.1.1 Chemikalien

3.1.2 Enzyme

3.1.3 Geräte

3.1.4 Kits

3.1.5 Bakterienstämme

3.1.6 DNA-Banken

3.1.7 Plasmide

3.1.8 Oligonukleotide

3.1.9 Zellinien

3.1.10 Antikörper

3.1.11 Puffer und Lösungen

3.1.12 Nährmedien

3.2 Methoden

3.2.1 Klonierung

3.2.2 Herstellung kompetenter Bakterien für Hitzeschock-Transformation

3.2.3 Herstellung kompetenter Bakterien für Elektrotransformation

3.2.4 Hitzeschock-Transformation

3.2.5 Elektrotransformation

3.2.6 Plasmid-Präparation

3.2.7 Southern-Blot

3.2.8 Ausplattieren von Bakteriophagen

3.2.9 Plaque-Transfer auf Nylonmembranen

3.2.10 Isolierung bzw. Vereinzelung von Phagenklonen

3.2.11 DNA-Präparation aus Phagen

3.2.12 Gelelektrophorese

3.2.13 Radioaktive Markierung von DNA-Restriktionsfragmenten

3.2.14 Radioaktive Markierung von Oligonukleotiden

3.2.15 Hybridisierung mit radioaktiven DNA-Sonden

3.2.16 DNA-Sequenzierung nach Sanger

3.2.17 Polymerasekettenreaktion (PCR)

3.2.18 RNA-Isolierung aus Geweben

3.2.19 Primer-Verlängerung nach Sambrook et al. (1989)

3.2.20 S1-Nuklease-Test (Ambion S1 Nuclease Protection Assay)

3.2.21 Gelretardationsversuche

3.2.22 DNaseI Footprints

3.2.23 Kernprotein-Präparation

3.2.24 Proteinisolierung aus Säugerzellen

3.2.25 SDS-PAGE und Immunoblot Analysen

3.2.26 Eukaryotische Zellkultur

3.2.27 Transfektion eukaryotischer Zellen durch Ca2PO4-Copräzpitation

3.2.28 b -Gal. Histochemie

3.2.19 b -Galactosidase-Test

3.2.30 CAT-Reportergen-Analysen

3.2.31 Computergestützte Sequenzanalysen

3.3 Sicherheitsmaßnahmen

4 Ergebnisse

4.1 Klonierung der Huntingtin-Promotorregionen bei Ratte und Mensch

4.1.1 Isolierung des Huntingtin-Promotors der Ratte

4.1.2 Isolierung der Promotorregion des menschlichen Huntingtin-Gens

4.2 Nutzung der klonierten Promotorregion des menschlichen Huntingtin-Gens in der MH-Gendiagnostik

4.3 Vergleichende Sequenzanalysen

4.4 Definition des Transkriptionsstartpunktes

4.4.1 Primer-Verlängerungsversuche

4.4.2 S1-Analysen

4.5 Funktioneller Nachweis von DNA-Sequenzen mit Promotoraktivität mittels CAT-Reportergenexpression

4.5.1 CAT-Reportergenanalysen am Promotor des Huntingtin-Gens der Ratte

4.5.2 CAT-Reportergenanalysen am Promotor des menschlichen Huntingtin-Gens

4.6 DNase I Schutzexperimente (Footprint-Analysen)

4.6.1 DNase I Schutzexperimente am Huntingtin-Promotor der Ratte

4.6.2 DNase I Schutzexperimente am menschlichen Huntingtin-Promotor

4.7 Gelretardationsversuche

4.7.1 Verdrängungsstudien am Huntingtin-Promotor der Ratte

4.7.2 Verdrängungsstudien am Huntingtin-Promotor des Menschen

4.8 Erzeugung transgener Mäuse mit einem LacZ-Reportergen unter Kontrolle des Huntingtin-Promotors

5 Diskussion

5.1 Klonierung des Huntingtin-Promotors von Ratte und Mensch

5.2 Nutzen der Promotorregion in der Gendiagnostik von MH

5.3 Bestimmung des Startpunktes der Transkription

5.4 Sequenzanalysen

5.5 Identifikation möglicher Transkriptionsfaktorbindestellen

5.6 Kernproteine binden spezifisch im Huntingtin-Promotor

5.7 Die hoch konservierte Region ist für die Expression unbedingt erforderlich

5.8 Huntingtin-LacZ Transgene Tiere

5.9 Ausblicke

6 Zusammenfassung

7 Literaturverzeichnis

7.1 Eigene Publikationen

7.2 Referenzen

8 Anhang

9 Lebenslauf


Einleitung

Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit einer schwerwiegenden neurodegenerativen Erbkrankheit des Menschen, dem Morbus Huntington (MH). Diese Erkrankung gehört zur Klasse der sogenannten "Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen". (La Spada et al., 1994; Ross, 1995; Warren et al., 1996). Trinukleotidblöcke können bei Übertragung auf die Nachkommenschaft betroffener Individuen weiter verlängert werden, wobei stärker verlängerte Trinukleotidblöcke im allgemeinen mit einem früheren Erkrankungsalter einhergehen. Das immer frühere Auftreten oder schwerere Ausprägung der Symptome in nachfolgenden Generationen bezeichnet man als Antizipation (Carpenter, 1994). Ursache für die Verlängerung ist die meiotische Instabilität der Triplett-Wiederholungen, was den Begriff der "dynamischen Mutation" geprägt hat (Richards und Sutherland, 1992). Im Tierreich sind keine Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen bekannt, so daß für keine der Krankheiten ein natürliches Tiermodell verfügbar ist.

Bisher wurden (GAA)n-, (CCG)n-, (CTG)n- und (CAG)n-Trinukleotidblöcke als Ursache neurologischer Erkrankungen des Menschen beschrieben (zusammengefaßt von Mandel, 1997). Darunter bilden die CAG-Expansionserkrankungen den Hauptteil der Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen. (CAG)n-Wiederholungen kodieren für Polyglutamin in den entsprechenden Genen, wobei relativ moderate Verlängerung der (CAG)n-Wiederholung und damit der Polyglutaminkette ausreichen, die Erkrankung auszulösen (Housman, 1995; Ross, 1995). Die CAG-Expansionserkrankungen werden auch als Typ-1-Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen zusammengefaßt (Ross, 1995).

Die Typ-2-Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen (Tabelle1) werden dagegen durch Verlängerungen von (GAA)n-, (CCG)n- und (CTG)n- Wiederholungen verursacht, die jedoch nicht im offenen Leserahmen des Gens lokalisiert sind und daher nicht für Aminosäuren kodieren. Gegenüber den CAG-Expansionserkrankungen zeigen Typ-2-Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen einige Besonderheiten (La Spada et al., 1994; Warren et al., 1996; Ross, 1995; Mandel, 1997). So expandieren die Trinukleotidblöcke bei betroffenen Individuen in der Regel bis zu mehreren Hunderten bzw. sogar Tausenden von Einheiten und sind mitotisch instabil, so daß die Länge von Trinukleotidblöcken in verschiedenen Geweben oder sogar verschiedenen Zellen eines Gewebes variieren kann. Die Mutationen führen aufgrund ihrer Lage in nichtkodierenden Regionen nicht zu veränderten Proteinen, sondern zu einer verminderten Proteinsynthese, wenn auch auf verschiedenen Mechanismen beruhend.

Tab. 1: Typ-2-Trinukleotid-Expansionserkrankungen (nach Robitaille et al., 1997)

Erkrankung

Fragiles X-Syndrom
(FraX-A)

Fragiles X-Syndrom
(FraX-E)

Myotone Dystrophie (DM)

Friedreich Ataxie *

Vererbung

X-chromosomal

X- chromosomal

Autosomal dominant

Autosomal rezessiv

Genort

Xq27.3

Xq28

19q13.2-13.3

9q13-q21.1

Triplett / Lage im Gen

CGG / 5‘ UTR
normal: 6-52
verlängert: 50->1000

GCC / 5‘ UTR
normal: 6-25
verlängert: 100->1000

CTG /
normal: 5-40
verlängert: 50-3000

GAA /
normal: 7-22
verlängert: 50-900

Protein

FMR-1

unbekannt

Myotonin Protein Kinase

Frataxin-Phosphatidylinositol Kinase

Klinische Merkmale

Mentale Retardierung,
Epilepsie, Prognatismus,
vergrößerte Ohren,
Makrogenitalien

Mentale Retardierung,
milder als bei FraX-A

Distale Myopathie mit Myotonie, mentale Retardierung, Hypogonadismus

Ataktischer Gang, Dysarthrie, Areflexie, Babinski-Zeichen, Cardiomyopathie

Pathologie

Selektive Hypertrophie cerebraler Strukturen, Mikrocephalie

unbekannt

Myopathie der Skelettmuskeln, cerbrale Atrophie

Neuronenverlust und Gliose, Waller-Degeneration spinaler Nerven

Betroffene Gehirnareale

Hippocampus, Striatum, Cerebellum

unbekannt

Distale Skelettmuskeln, Temporallappen

Dorsale Wurzelganglien, spinocerebelläre Bereiche, posteriore Säulen, laterale und Clarke-Säulen

Die übrigen 8 bisher bekannten Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen gehören zur Klasse der CAG-Expansionserkrankungen oder Typ-1-Trinukleotid-Expansionserkrankungen (Tabelle 2). Die Mutationen liegen jeweils in den kodierenden Regionen der entsprechenden Gene und sind weit im Genom verteilt. Bei jeder Erkrankung ist ein anderes Protein betroffen. Trotz dieser Diversizität wird aufgrund des gemeinsamen Mutationstyps und des neurodegenerativen Charakters der Erkrankungen ein teilweise gemeinsamer pathogenetischer Mechanismus vermutet.

 

Tab. 2: Typ-1-Trinukleotid-Expansionserkrankungen (nach Robitaille et al., 1997)

Erkrankung

Spinale und bulbäre Muskel-Atrophie
(SBMA)

Spinocerebeläre Ataxie 1
(SCA1)

Spinocerebeläre Ataxie 2
(SCA2)

Spinocerebeläre Ataxie 3
(SCA3 = MJD) *

Vererbung

X-chromosomal

Autosomal dominant

Autosomal dominant

Autosomal dominant

Genort

Xq11-q12

6p23

12q24

14q24.3-q31

Triplett

CAG
normal: 12-33
verlängert: 40-62

CAG
normal: 9-39
verlängert:41-81

CAG
normal: 15-34
verlängert: 34-64

CAG
normal: 12-34
verlängert: 55-84

Protein

Androgen Rezeptor

Ataxin-1

Ataxin-2

Ataxin-3

Klinische Merkmale

Defizite motorischer Hirnnerven, Amyotrophie, sensorische Neuropathie

Ataxie, Dysarthrie, Dysphagie, Amyotrophie distaler Gliedmaßen, Pyramidenbahnzeichen

Ataxie, Dysarthrie, sensorimotorische Neuropathie, Demenz (selten)

Ataxie, Defizite cranialer Nerven, extrapyramidale Zeichen, pyramidale Zeichen, Exophthalmus

Pathologie

Gynäkomastie, Verlust motorischer Neurone, distale Axonopathie, Atrophie der Wurzelganglien

Neuronale Atrophie und Verlust, Atrophie anteriorer Wurzeln der Spinalnerven

Neuronenverlust und Gliose, Atrophie anteriorer Wurzeln der Spinalnerven, motorische und sensorische Axonopathie

Neuronenverlust und Gliose, Atrophie anteriorer Wurzeln der Spinalnerven, motorische und sensorische Axonopathie

Betroffene Gehirnareale

Motorische Zentren des Hirnstamms, Vorderhornzellen, dorsale Wurzelganglien

Pontine Kerne, Olivenkerne, dentatorubrale Vorderhornzellen, Kleinhirnrinde, Clarke- und posteriore Säulen

Pontine Kerne, Olivenkerne, Substantia nigra, Kleinhirnrinde, selten Atrophie der Großhirnrinde

Pontine Kerne, Kleinhirnrinde, craniale Nervenkerne, Substantia nigra

* Für SCA 4 und SCA5 ist bisher keine CAG-Verlängerung nachgewiesen

 

Erkrankung

Spinocerebeläre Ataxie 6
(SCA6)

Spinocerebeläre Ataxie 7
(SCA7)

Dentatorubrale pallidoluysiane Atrophie
(DRPLA)

Morbus Huntington
(MH)

Vererbung

Autosomal dominant

Autosomal dominant

Autosomal dominant

Autosomal dominant

Genort

19p13

3p12-13

12p13.31

4p16.3

Triplett

CAG
normal: 6-17
verlängert: 21-28

CAG
normal: 7-35
verlängert: 37-130

CAG
normal: 7-23
verlängert:49-75

CAG
normal: 9-34
verlängert:37-121

Protein

a 1A-spannungsabhängiger Kalzium-Kanal

Ataxin-7

Atrophin-1

Huntingtin

Klinische Merkmale

Ataxie, langsam fortschreitende Dysarthrie, Nystagmus, Hyporeflexie, Wahrnehmungsverluste

Ataxie mit Degeneration der Retina, Blindheit

Ataxie, choreatische Athetose psychiatrische Störungen, Demenz, progressive myoklonische Epilepsie

Psychiatrische Störungen, Chorea, Cognitive Defekte, Demenz

Pathologie

Neuronenverlust und Gliose

Neuronenverlust und Gliose

Neuronenverlust, Gliose, Waller-Degeneration spinaler Nerven

Neuronenverlust und Gliose

Betroffene Gehirnareale

Kleinhirnrinde (Purkinje-Zellen), Olivenkerne, Atrophie des Hirnstamms, milde sensorimotorische Neuropathie

Pontine Kerne, Olivenkerne, Kleinhirnrinde, Retina

Dentatorubrales und pallidoluysianes System Olivenkerne, tegmentale Kerne, Kleinhirnrinde, lange Bahnen des Rückenmarks, motorische Neurone

Neostriatum, Nucleus caudatus, Putamen, Pallidum, Thalamuskerne, Subthalamuskerne, Pars reticulata der Substantia nigra

 

Neben offensichtlichen Gemeinsamkeiten gibt es aber auch wichtige Unterschiede. Diese Unterschiede beziehen sich vor allem auf die Orte der Neurodegeneration, die bei ähnlichen Symptomen voneinander abweichen (Tabelle2). So war es bisweilen schwierig, ohne neuropathologische Untersuchungen zwischen DRPLA und MH zu unterscheiden.

Eine Sonderstellung nimmt SCA6 ein. Bei SCA6 umfaßt der (CAG)n-Block des expandierten Allels lediglich 22-28 Trinukleotid-Einheiten. Es ist damit die kürzeste bekannte Trinukleotid-Expansion, die eine Spinocerebelläre Ataxie verursacht. Für andere Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen liegen derartige (CAG)n-Blöcke noch im Bereich der Normalallele. Das verlängerte Allel von SCA6 zeigt zudem nur eine sehr geringe Variabilität und fast keine meiotische Instabilität (Rieß et al., 1997), während bei allen anderen Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen ca. 70% der expandierten Allele instabil vererbt werden (Zühlke et al., 1993b). Das Genprodukt des SCA6 Gens ist der a 1A-Kalziumkanal, der wichtig ist für die normale Funktion und das Überleben von Purkinje-Zellen (Mori et al., 1991, Llinas et al., 1992). Damit ist das SCA6 Genprodukt als einziges unter den bekannten CAG-Expansionserkrankungen ein Membranprotein, so daß sich möglicherweise die Pathogenese von SCA6 grundlegend von den anderen CAG-Expansionserkrankungen unterscheidet. Dafür spricht ebenfalls, daß für den a 1A-Kalziumkanal "Missense"-Mutationen beschrieben wurden, die mit familiärer hemiplegischer Migräne und episodischer Ataxie Typ 2 assoziiert sind. Episodische Ataxie Typ 2 ist eine Erkrankung, die einige gemeinsame Merkmale mit SCA6 aufweist (Ophoff et al., 1996).

Morbus Huntington

Pathologie

Morbus Huntington (MH) ist eine autosomal dominant vererbte neurodegenerative Erkrankung, die als "Chorea" erstmals von George Huntington beschrieben wurde (Huntington, 1872). Man schätzt, daß in den meisten westlichen Ländern ca. 0,01% der Bevölkerung Genträger für MH sind (Harper et al., 1991). Das Ausbruchsalter der Krankheit ist sehr variabel und reicht von der ersten bis zur siebten Lebensdekade. Das mittlere Ausbruchsalter liegt aber zwischen 30 und 70 Jahren (Chandler et al., 1960). Die progressiv fortschreitenden Symptome der Krankheit reichen von unwillkürlichen, ausfahrenden Bewegungen der Extremitäten (Chore, griech.: Tanz), Zuckungen der Gesichtsmuskulatur, Koordinations- und Gangstörungen, Verlust intellektueller Fähigkeiten (Demenz) bis zu Depressionen, Reizbarkeit und Persönlichkeitsveränderungen und führen etwa 17 Jahre nach Auftreten der ersten Symptome zum Tod.

In den seltenen juvenilen Fällen ist der Krankheitsverlauf etwas verändert und ähnelt dem der DRPLA. Während die choreatischen Bewegungen nur geringfügig oder gar nicht zu beobachten sind, erfolgt nach Ausbruch der Erkrankung ein rapider Abbau der intellektuellen Fähigkeiten. Der Tod tritt schon nach wenigen Jahren ein (Furtado und Suchowesky, 1995).

Ursache für diese Symptome ist das Absterben von Nervenzellen in bestimmten Gehirnzentren, was zum Schrumpfen der entsprechenden Bereiche führt. Mit Verfahren wie Röntgen- oder Magnetfeldtechnik lassen sich die Hirnveränderungen bereits vor dem sichtbaren Ausbruch der Erkrankung nachweisen. Untersuchungen an post mortem Gehirnen von Betroffenen zeigen einen Verlust von Neuronen einhergehend mit Astrocytose hauptsächlich im Caudatum, zusätzlich im Putamen und in späteren Stadien der Erkrankung im cerebralen Cortex. Kleine Neurone erwiesen sich als verletzlicher für den neurodegenerativen Prozess als große Neuronen. Bereits vor dem Gewebeverlust läßt sich mittels Positronenemmissionstomographie (PET) ein Hypometabolismus von Glucose im Nucleus caudatus nachweisen (Hayden et al., 1986).

Genetik

Morbus Huntington wurde 1983 auf das Ende des kurzen Armes von Chromosom 4 kartiert. Es konnte die Kopplung mit dem polymorphen Marker G8 gezeigt werden (Gusella et al., 1983), der auf dem 7. "Human Gene Mapping Workshop" in Los Angeles 1983 in D4S10 umbenannt wurde.

Nachdem der Marker D4S10 durch in situ Studien in Bande 4p16.1 lokalisiert werden konnte (Landegent et al., 1986), wurde mit der Klonierung der Kandidatenregion für MH in artifizielle Hefechromosomen (YAC) eine Grundlage zur gezielten Suche nach Kandidatengenen geschaffen (Zuo et al., 1992).

In einer internationalen Zusammenarbeit von 58 Wissenschaftlern aus 6 Arbeitsgruppen ist es letztendlich 10 Jahre nach der Lokalisation auf Chromosom 4 gelungen, das Gen und die krankheitsverursachende Mutation zu identifizieren. (The Huntington’s Disease Collaborative Research Group, 1993)

Das neue Gen IT15 ("important transcript 15"), das später in "Huntingtin"-Gen umbenannt wurde, hat - abgesehen von der polymorphen (CAG)n-Wiederholung - keinerlei Ähnlichkeiten zu bisher bekannten Genen und besteht aus 67 Exonen zwischen 48 und 341 bp Länge, die sich über 180 kb genomische Sequenz erstrecken. Es wurden 2 alternativ polyadenylierte und ubiquitär exprimierte Transkripte nachgewiesen, wobei sich die Expression in neuronalen Geweben als besonders hoch erwies (Ambrose et al., 1994).

Wie bereits erwähnt, ist MH eine autosomal dominant vererbte Erkrankung mit progressivem Verlauf und (nahezu) vollständiger Penetranz. Lediglich bei Intermediärallelen mit 36-39 (CAG)-Einheiten wurde inkomplette Penetranz beobachtet (Brinkmann et al., 1997). Direkte Ursache der Krankheit ist die Verlängerung eines (CAG)n-Trinukleotidblocks in der 5'-kodierenden Region des Huntingtin-Gens über 38 Einheiten. Die Trinukleotid-Blocklänge korreliert dabei indirekt mit dem Erkrankungsalter (Andrew et al., 1993; Duyao et al., 1993; Snell et al., 1993; Zühlke et al., 1993a; Nörremölle et al., 1993). Inzwischen kann man Wahrscheinlichkeitsangaben für das Manifestationsalter bei gegebenen (CAG)n-Längen errechnen (Brinkmann et al., 1997), aber neben der Länge des (CAG)n-Trakts werden weitere Einflußfaktoren auf das Erkrankungsalter vermutet.

Bei der Vererbung zwischen den Generationen kommen sowohl Expansionen wie Kontraktionen des (CAG)n-Blocks vor. Während bei Normalallelen die Mutationshäufigkeit sehr niedrig ist, beträgt sie bei den expandierten Allelen ca. 70 % (Zühlke et al., 1993b). Insgesamt sind bei paternaler Transmission Expansionen wesentlich häufiger als bei maternaler Weitergabe, übereinstimmend mit der Beobachtung, daß juvenile MH-Fälle praktisch immer von väterlichen expandierten Allelen verursacht werden (Zühlke et al., 1993b). Diese verstärkte Expansion erklärt die oft beobachtete Antizipation, also das frühere Erkrankungsalter und Zunahme des Schweregrades der Erkrankung bei Weitergabe des expandierten Allels auf die nächste Generation.

Expression und intrazelluläre Lokalisation des Huntingtin-Proteins

Das Huntingtin-Protein wird in neuronalen und nichtneuronalen Geweben exprimiert (Gutekunst et al., 1995; Strong et al., 1993; Li et al., 1993; Trottier et al., 1995; Schmitt et al., 1995; DiFiglia et al., 1995; Schilling et al., 1995; Sharp et al., 1995; Gourfinkel et al., 1997; Sapp et al., 1997). Mittels in situ Hybridisierung und immunohistochemischen Methoden ist mRNA beziehungsweise Huntingtin-Protein im gesamten Gehirn nachweisbar, mit höheren Konzentrationen im Gyrus dentatus, den pyrimidalen Neuronen des Hippocampus, der granulären Zellschicht des Cerbellums, cerebellaren Purkinje-Zellen und den pontinen Kernen. In allen Regionen prädominiert die neuronale gegenüber der glialen Expression. In den Basalganglien, der vorwiegend von der Neurodegeneration betroffenen Region, findet sich keine Anreicherung von Huntingtin. In Patienten werden sowohl die normale als auch die verlängerte Form des Proteins gleichermaßen exprimiert. Geringere Proteinkonzentrationen im Caudatum von Patienten sind wahrscheinlich auf den Zellverlust durch Neurodegeneration zurückzuführen (Schilling et al., 1995; Sapp et al., 1997).

Neben der starken Expression im Gehirn konnte aber auch die Expression von Huntingtin in allen untersuchten peripheren Geweben nachgewiesen werden, mit mittleren Konzentrationen in Organen wie Lunge, Hoden, Ovarien und Milz und niedrigen Konzentrationen in Herz, Darm, Leber, Pankreas und Niere (Li et al., 1993; Strong et al., 1993). An Ratten konnte nachgewiesen werden, das Huntingtin während der Embryogenese in neuronalen und nichtneuronalen Geweben stark exprimiert wird, aber im weiteren Verlauf der Entwicklung in nichtneuronalen Geweben herunterreguliert wird (Schmitt et al., 1995).

Auch die subzelluläre Verteilung des Huntingtin Proteins wurde untersucht. Demnach ist Huntingtin ein zytoplasmatisches Protein, das vorwiegend in Nervenenden lokalisiert ist. Es scheint dabei mit Mikrotubuli in Zellkörpern, Dendriten und Axonen und mit synaptischen Vesikeln gekoppelt zu sein (Gutekunst et al., 1995; DiFiglia et al., 1995; Trottier et al., 1995; Sharp et al., 1995). Im Cortex und Striatum von MH-Patienten konnte häufig auch eine moderate bis intensive Färbung des Zellkerns nachgewiesen werden (Sapp et al., 1997). Außerdem konnte kürzlich gezeigt werden, daß sich die zelluläre Verteilung des normalen von der des mutierten Huntingtins unterscheidet (Gourfinkel et al., 1997). Die normale und die mutierte Form sind in einigen neuronalen Perikaryen und Nervenfasern nachweisbar, aber während die normale Form auch in Nervenenden zu finden ist (s.o.), konnte die mutierte Form dort nicht nachgewiesen werden.

Molekulare Mechanismen der Krankheitsentstehung

Es gibt bisher keine Erklärung dafür, warum der genetische Defekt dieses ubiquitär exprimierten Gens nur zu einer Degeneration von bestimmten Nervenzellen führt. Die Expressionsstärke des betroffenen Allels wird durch die Mutation aber nicht beeinträchtigt (Li et al., 1993). Identische mRNA- und Proteinmengen in MH-Patienten und Kontrollen (Landwehrmeyer et al., 1995 und Schilling et al., 1995) sowie Erkenntnisse von Tiermodellen (s.u.) sprechen dafür, daß die Expansion des Polyglutamintrakts eine veränderte oder zusätzliche Funktion des Huntingtin-Proteins bewirkt ("gain-of-function" Mutation).

So wurde vermutet, daß lange Polyglutaminketten über Wasserstoffbrücken in antiparalleler Ausrichtung miteinander aggregieren könnten (Perutz et al., 1994). Dieser sogenannte "polar zipper" könnte eine Haarnadelstruktur innerhalb eines Polyglutaminstranges bilden oder zwei Moleküle mit Polyglutaminen verbinden. Andere Moleküle könnten dann mit diesem Komplex eine stabile b -Faltblattstruktur ausbilden und innerhalb der Zelle präzipitieren. Diese Theorie ist auch prinzipiell auf die anderen in Tabelle 2 zusammengefaßten CAG-Expansionserkrankungen anwendbar, die durch Expansionen ähnlicher Größe wie bei MH ausgelöst werden (mit Ausnahme von SCA6, s.o.). Trotzdem erklärt diese Theorie nicht die regionenspezifische Pathologie der einzelnen Erkrankungen.

Die Bildung von Polyglutamin-haltigen Aggregaten konnte tatsächlich mit einem nur aus Exon 1 bestehendem Huntingtin-Fragment in vitro nachgewiesen werden (Scherzinger et al., 1997). Strukturelle Untersuchungen der Aggregate lieferten Hinweise auf b -Faltblattstrukturen. Weitergehende Untersuchungen wurden an transgenen Tieren durchgeführt, die Exon 1 des Huntingtin-Proteins mit einem sehr langen (CAG)n-Block von 115-156 Einheiten überexprimieren. Diese Tiere zeigten einen progressiven neurologischen Phänotyp (Mangiarini et al., 1996) und Untersuchungen der Gehirne dieser Mäuse zeigten intranukleäre Einschlüsse, die mit Antikörpern gegen den N-Terminus von Huntingtin oder gegen Ubiquitin nachweisbar waren (Davies et al., 1997). Durch Ubiquitinierung von Proteinen werden diese Proteine markiert, von Proteasen erkannt und abgebaut. Dieser degenerative Mechanismus wird von der Zelle auch zum Abbau falsch gefalteter Proteine genutzt (Finley und Chau, 1991). Kalchman et al. (1996) konnten unter Anwendung des "Yeast two-hybrid"-Systems zeigen, daß Huntingtin mit einem Ubiquitin-konjugierenden Enzym interagiert, das dieselbe Aminosäuresequenz aufweist wie das aus dem Rind bekannte Ubiquitin-konjugierende Enzym E2-25K (Chen et al., 1991). Diese Enzym gehört zu einer Familie von Proteinen, die andere Proteine durch kovalente Bindung von Ubiquitin an einen Lysinrest des Zielproteins zum Abbau markieren. Besonders viele Einschlüsse sind in Cortex und Striatum sichtbar, also den am meisten von der Krankheit betroffenen Regionen. Die Einschlußkörperchen enthalten fibrilläre und amorphe Ablagerungen von Huntingtin, was das Modell der Proteinaggregation unterstützt.

Ähnliche Einschlüsse sind auch bei transgenen Mäusen nachgewiesen worden, die das Ataxin-1 Gen mit CAG-Expansion unter der Kontrolle eines für Purkinje Zellen spezifischen Promotors enthalten. In den Zellkernen der Purkinje Zellen bilden sich kleine Ablagerungen, die zur Degeneration der Zellen führen, wie es auch bei SCA1-Patienten zu sehen ist (Skinner et al., 1997). Auch in Zellkultur konnten ähnliche Ergebnisse erzielt werden, denn transient mit Ataxin-1 oder Ataxin-3 transfektierte eukaryotische Zellen zeigten ebenfalls kleine intranukleäre Einschlüsse (Paulson et al., 1997, Skinner et al., 1997).

Obwohl bereits mehrere Jahrzehnte mit pathologischem Material von Patienten mit neurodegenerativen Erkrankungen gearbeitet wird, sind niemals intranukleäre Einschlüsse als pathognomisch für diese Erkrankungen beschrieben worden. Es ist daher bemerkenswert, daß im letzten Jahr gleich in 4 dieser Erkrankungen intranukleäre Einschlüsse identifiziert wurden. (Becher et al., 1997; DiFiglia et al., 1997; Paulson et al., 1997; Skinner et al., 1997). Die Einschlüsse sehen sich in allen Fällen sehr ähnlich. Es sind deutlich abgegrenzte, ca. 2 µm breite Strukturen ohne umgebende Membran, die deutlich vom Nukleolus unterscheidbar sind. Manche Neurone können zwei oder drei Einschlußkörperchen aufweisen, aber die meisten Neurone haben nur eins. Bei MH hat sich zudem gezeigt, daß eine deutliche Korrelation zwischen längeren (CAG)n-Wiederholungen und steigender Dichte der Einschlußkörperchen besteht (Becher et al., 1997).

All diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, daß expandierte Polyglutamine toxisch wirken könnten. Um diese Theorie zu untermauern, wurde ein langer (CAG)n-Trakt in das Gen für Hypoxantin-Guanin Phosphoribosyltransferase (HPRT) der Maus eingefügt und tatsächlich waren intranukleäre Einschlüsse sichtbar und die Mäuse zeigten einen deutlichen progressiven Phänotyp mit Ataxie und vorzeitigem Tod (Ordway et al., 1997). Ein Polyglutaminanteil kann also selbst in einem ektopischen Protein ohne offensichtliche neurologische Funktion einen progressiven neurologischen Phänotyp mit inranukleären Einschlüssen hervorrufen.

Diese Erkenntnisse führten zur Formulierung eines Modells zur Entstehung intranukleärer Einschlüsse, nach dem das Polyglutaminabschnitte enthaltende Protein (wie zum Beispiel Huntingtin) seine Konformation ändert und über Bildung eines "polaren Reißverschlusses" ("polar zipper", s.o.) in eine b -Faltblattstruktur übergeht (Perutz et al., 1994; Ross, 1997). Das Protein mit der Polyglutaminexpansion wird anschließend durch Caspase 3 und andere Enzyme proteolytisch gespalten (Goldberg et al., 1996). Das N-terminale Fragment ist nun klein genug, um in den Zellkern gelangen zu können, wo es möglicherweise an die Kernmatrix bindet und sich über die b -Faltblattstrukturen zu Aggregaten zusammenlagert. Möglicherweise können diese Aggregate nicht abgebaut werden oder die Zelle geht aufgrund der veränderten Protein-Protein Wechselwirkungen oder durch Beeinflussung des Trankriptionsapparates zugrunde (Ross, 1997).

Nach einer weiteren Theorie sind Proteine mit verlängerten Polyglutaminabschnitten bessere Substrate für Transglutaminasen (Green, 1993). Transglutaminasen sind eine Familie von Enzymen, die die Quervernetzung von Proteinen über e -g -Glutamyl-Lysin Isodipeptid-Bindungen katalysieren. Ein toxischer Effekt auf die Zellen könnte entweder durch die quervernetzten Proteine selbst oder durch Proteolyse entstehende unlösliche Isodipeptide zustande kommen. Langlebige Zellen wie Neurone wären für derartige, nicht abbaubare Proteinaggregate besonders anfällig (Green, 1993; Ross, 1995). Diese Theorie wird unterstützt durch die Beobachtung, daß die Quervernetzung von Huntingtin durch Transglutaminasen in vitro zur Entstehung hochmolekularer Polymere führt, und zwar in Abhängigkeit von der Länge des Polyglutaminabschnitts. Die Polymerisation ließ sich jedoch durch Transglutaminase-Inhibitoren verhindern (Kahlem et al., 1998). Ähnliche Versuche zeigten, daß auch ein verkürztes Proteinprodukt des DRPLA-Gens mit verlängertem Polyglutamin-abschnitt in Zellkultur peri- und intranukleäre Aggregate bilden kann. Auch in diesem Fall war die Quervernetzung durch Transglutaminase-Inhibitoren hemmbar und die Apoptoserate der Zellen wurde verringert (Igarashi et al., 1998).

Wechselwirkungen mit anderen Proteinen

In den letzen Jahren sind mehrere Proteine identifiziert worden, die mit dem Huntingtin-Protein interagieren können.

Über das "Yeast two-hybrid system" konnte ein Protein (HAP-1 für "Huntingtin Associated Protein") isoliert werden, das an das Huntingtin-Protein bindet. Die Bindung erwies sich als besonders stark bei expandierten Polyglutamintrakt. Northern Blot Analysen haben gezeigt, daß HAP1 mRNA nur im Gehirn zu finden ist, mit besonders hoher Expression im Striatum und im Bulbus olfactoris und schwacher Expression im Rückenmark, Cerebellum und Großhirnrinde (Li et al., 1995). Ein weiteres Protein, das in Abhängigkeit von der Länge des Polyglutaminabschnittes an Huntingtin bindet, ist HIP-1 ("Huntingtin Interactor Protein"). Auch dieses Protein wurde über das "Yeast two-hybrid system" isoliert (Wanker et al., 1997) und weist Homologien zu dem Hefeprotein Sla2p auf (Holtzman et al., 1993). Darüber hinaus interagiert Huntingtin mit einem E2 konjugierendem Enzym (hE2-25k), allerdings nicht in Abhängigkeit von der Polyglutamin-Länge (Kalchman et al., 1996). Kürzlich wurde gezeigt, daß Huntingtin durch Apopain (Caspase 3) proteolytisch gespalten werden kann (Goldberg et al., 1996). Da die zur Caspase Familie gehörenden Proteasen mit Apoptose in Verbindung gebracht werden, ist das ein sehr interessanter Befund. Wie Atrophin-1, dem Genprodukt des DRPLA-Gens, interagiert auch Huntingtin spezifisch mit GAPDH, wie durch Affinitätssäulenchromatographie gegen Polyglutamin nachgewiesen wurde (Burke et al., 1996). GAPDH (Glycerinaldehyd-3-Phosphat Dehydrogenase) ist ein multifunktionales Enzym mit Funktionen in der Glykolyse und in der Replikation und Reparatur von DNA (Harris und Perham, 1963; Meyer-Siegler et al., 1991; Ronai, 1993). Eine Beeinträchtigung des Energiestoffwechsels in MH und anderen neurodegenerativen Erkrankungen ist bereits mehrfach als an der Pathogenese beteiligter Mechanismus diskutiert worden (Beal, 1995; Beal et al., 1993; Coyle und Puttfarcken, 1993). Allerdings ist die Interaktion mit GAPDH aufgrund der Expression in fast allen Geweben nicht geeignet, die regionale Spezifität der Neuropathologie zu erklären.

Tiermodelle

Bisher sind im Tierreich keine Trinukleotidexpansionen bekannt und infolge dessen auch keine natürlichen Tiermodelle für eine der Trinukleotidblock-Expansionserkrankungen. Deshalb ist man auf die Generierung künstlicher Tiermodelle angewiesen, die aber oft nur ein unvollkommenes Bild der Erkrankung liefern.

Um etwas über die normale Funktion von Huntingtin zu erfahren, wurde das Huntingtin-Gen von mehreren Arbeitsgruppen in transgenen Mäusen gezielt inaktiviert (Nasir et al., 1995; Duyao et al., 1995; Zeitlin et al., 1995). Über homologe Rekombination wurde das Huntingtin-Gen unterbrochen ("knock out" Tiere) und für die Veränderung heterozygote und homozygote Mäuse untersucht. Homozygote Tiere erwiesen sich als embryonal letal und starben nach abnormaler Gastrulation zwischen Tag 7,5 und 10,5 der Embryonalentwicklung. Die Embryos starben vor der Bildung der Somiten und vor Beginn der Organogenese. Das embryonale Ektoderm war stärker von der Apoptose betroffen als andere embryonale Gewebe. Heterozygote Mäuse waren bei Zeitlin et al. (1995) und Duyao et al. (1995) phänotypisch normal, während die Mäuse bei Nasir et al. (1995) erhöhte motorische Aktivität und kognitive Defekte zeigten. Diese Unterschiede sind vermutlich auf Unterschiede bei der Inaktivierung des Huntingtin-Gens zurückzuführen. Bei Zeitlin et al. (1995) wurde das Gen durch Entfernung des Promotors und des ersten Exons komplett inaktiviert, während in den anderen beiden Fällen die gezielte Insertion eines Neomycinresistenzgens in Exon 4 (Duyao et al., 1995) bzw. Exon 5 (Nasir et al., 1995) noch die Synthese von verkürztem Huntingtin ermöglicht. Der letale Phänotyp der homozygot transgenen Tiere ließ sich wieder "retten", indem ein zusätzliches Transgen mit einem in YACs klonierten menschlichen Huntingtin-Gen eingeschleust wurde (Hodgson et al., 1996). Diese Versuche zeigen, daß Huntingtin essentiell für die Embryonalentwicklung ist und daß das menschliche Huntingtin-Gen in der Maus funktionell ist.

Mangiarini et al. (1996) haben Mäuse hergestellt, die transgen für den Promotor und das 5‘-Ende (Exon 1) mit einem expandiertem (CAG)130 Block des humanen Huntingtin-Gens sind. In 3 Mauslinien wurde das Transgen sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene ubiquitär exprimiert. Die Mäuse entwickelten einen progressiven neurologischen Phänotyp mit vielen MH-typischen Merkmalen wie choreatische Bewegungen, unwillkürlichen stereotypischen Bewegungen, Tremor und epileptische Anfälle, jedoch ohne Neurodegeneration.

White et al. (1997) haben über homologe Rekombination das erste Exon des Huntingtin-Gens der Maus durch ein chimäres Exon 1 mit 48 (CAG)-Einheiten eines MH Patienten ersetzt ("knock in"-Strategie). Für dieses Konstrukt heterozygote und homozygote Mäuse exprimieren das expandierte Protein auf mRNA- und Proteinebene, zeigen aber nach 6 Monaten noch keine neurologischen Symptome. Außerdem wurde ein weiteres Konstrukt eingesetzt, das in der Promotorregion ca. 950 bp 5‘ vom Translationsstartpunkt ein Neomycinresistenzgen enthält. Dieses Konstrukt wird nur in sehr geringem Maß exprimiert und homozygote Mäuse starben spätestens 2 Tage nach der Geburt aufgrund schwerer Mißbildungen des Zentralnervensystems. Die Autoren leiten daraus eine Funktion des Huntingtin Proteins bei der Bildung des Zentralnervensystms ab.

Von Goldberg et al. (1996) erzeugte transgene Mäuse mit einem (CAG)44 Block in der vollständigen humanen Huntingtin cDNA zeigten auch nach über einem Jahr keinen neurologischen Phänotyp. Wie sich herausstellte, verhinderte sowohl die Anwesenheit von 120 bp der 5‘UTR als auch eine als Klonierartefakt entstandene Rasterschubmutation in der translatierten Region des Gens die Expression der cDNA, obwohl große Mengen der mRNA gebildet wurde. Dieser Versuch zeigt, daß die Anwesenheit der mRNA mit expandiertem (CAG)n-Block nicht ausreicht, die Erkrankung zu verursachen und daß MH folglich nicht durch DNA-RNA Wechselwirkungen oder durch Wechselwirkung der RNA mit Proteinen verursacht werden kann.

Von Martindale et al. (1998) wurden transgene Mäuse erzeugt, die das vollständige Huntingtin mit auf 138 Einheiten verlängerten Polyglutaminabschnitt unter der Kontrolle eines hCMV IE1-Promotors exprimieren. Obwohl nachgewiesen wurde, daß tatsächlich Protein gebildet wird und in einem kleinen Anteil (ca. 1%) der Neurone in Cortex und Striatum perinukleäre Aggregate nachweisbar waren, entwickelten die Mäuse keinen neurologischen Phänotyp. Dies stimmt mit der Beobachtung überein, daß die Expression von Luciferase- und LacZ-Reportergenen unter der Kontrolle des hCMV IE1-Promotors im Gehirn verglichen mit anderen Geweben nur in sehr geringem Maße stattfindet (Furth et al., 1994).

Diese Beispiele verdeutlichen die Bedeutung der Regulation der Genexpression für die Entwicklung transgener Tiermodelle und zeigen die Notwendigkeit, Tiermodelle mit dem nativen Huntingtin-Promotor zu entwickeln.

Eukaryotische Promotoren und Genexpression

Für die Zelle gibt es mehrere Möglichkeiten, die Menge eines bestimmten Genproduktes zu regulieren. Die erste Möglichkeit ist die Kontrolle der Transkription, aber es gibt auch zahlreiche posttranskriptionelle Mechanismen, wie alternatives Spleißen, Regulation der Stabilität der mRNA, Regulation der Translation, Modifikation von Proteinen und Regulation des Proteinabbaus bzw. der Stabilität von Proteinen (Latchman, 1990; Ashkenas und Byers, 1997).

Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit dem Promotor des Huntingtin-Gens, weshalb in dieser Einleitung nur auf die Regulation der Transkription näher eingegangen werden soll.

Anders als bei der Transkription bei Prokaryoten, sind es bei eukaryotischen RNA-Polymerasen in erster Linie Faktoren und nicht die Enzyme selbst, die für die Erkennung der Bestandteile eines Promotors verantwortlich sind. Jeder Promotor enthält charakteristische Gruppen kurzer, konservierter Sequenzen, die von passenden Transkriptionsfaktoren und/oder RNA-Polymerasen erkannt werden. Jeder Promotor ist also modulartig aufgebaut (Dynan, 1989; Locker und Buzard, 1990). Transkriptionsfaktorbindestellen werden auch als cis-aktive Stellen bezeichnet und die entsprechenden Transkriptionsfaktoren in Analogie dazu als trans-aktive Faktoren. Jedes Modul bzw. Transkriptionsfaktorbindestelle besteht aus einer kurzen Konsensussequenz, in der meist keine Sequenzabweichungen toleriert werden. Die Sequenz um diesen "Kern" herum kann jedoch stärker variieren und so die Wirksamkeit der Proteinbindung beeinflussen (Merika und Orkin, 1993). Mit der Bindung der Faktoren an die DNA geht der Aufbau eines Komplexes einher, wobei Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Proteinen eine wichtige Rolle spielen. Kofaktoren binden selbst nicht an die DNA, aber können mit Transkriptionsfaktoren interagieren. Die RNA-Polymerase, die selbst nicht an die DNA binden kann, bindet als Teil dieses Komplexes. Dieses große Proteinkonglomerat, das neben der RNA Polymerase II (ein Multiproteinenzym) auch eine Reihe basaler Transkriptionsfaktoren wie TFIIB, TFIIE, TFIIF und/oder TFIIH sowie einige weitere zum Teil noch unbekannte Proteine enthält, bezeichnet man als RNA Polymerase II Holoenzym (Koleske und Young, 1995).

Man kann verschiedene Gruppen von Faktoren und cis-Elementen unterscheiden:

     

  1. Faktoren, die für die Einleitung der Transkription unbedingt erforderlich sind und deshalb in allen Zellen vorkommen. Dazu gehören Proteine, die an die allgemeinen Promotor-Elemente wie TATA-Box, CAAT-Box und GC-Box binden.
  2. Faktoren, die das zelltypspezifische Programm einer Zelle regulieren. Dies sind insbesondere Proteine, die nur in bestimmten Zellen und nur während bestimmter Differenzierungszustände aktiv sind und damit die Expression von spezifischen Genen in diesen Zellen regulieren.
  3. Faktoren, die in vielen Zellen vorkommen, aber erst bei bestimmten Signalen aktiviert werden (Reaktionselemente oder engl.: "response elements"). Diese Faktoren sind also an der Regulation induzierbarer Gene beteiligt, zum Beispiel im Zuge einer Hitzeschock-Antwort oder bei Reaktion auf Wachstumsfaktoren oder Steroidhormone.

Promotorbestandteile werden anhand ihrer Funktion durch die Forderung definiert, daß sie in der Nähe des Startpunktes der Transkription liegen müssen und für die Initiation notwendig sind. Sequenzen, die die Transkription verstärken können, werden "Enhancer" genannt. "Enhancer" können weit vom Startpunkt entfernt liegen, und zwar sowohl stromaufwärts wie stromabwärts in beliebiger Orientierung. "Enhancer" und Promotor sind homologe Einheiten, da beide modulartig aufgebaut sind und manche Module bzw. cis-Elemente sowohl in "Enhancern" als auch Promotoren vorkommen können. Lediglich Elemente, die den Transkriptionsstartpunkt festlegen (TATA-Box, Initiator), findet man nicht in "Enhancern" (Dynan, 1989).

Mechanismen, über die cis-Elemente die Transkription über große Entfernungen aktivieren, sind immer noch nicht aufgeklärt. Es werden aber spezifische Protein-Protein-Interaktionen zwischen bestimmten, an distalen Elementen gebundenen Transkriptionsfaktoren und Faktoren des Initiationskomplexes vermutet, so daß selbst weit distal gebundene Faktoren direkt am Initiationsprozess beteiligt sein könnten. Dieses momentan favorisierte Modell setzt eine Schleifenbildung voraus, die jeweiligen Elemente in räumliche Nähe zueinander bringt (Mitchell und Tjian, 1989).

Aufgrund des sehr ähnlichen modulartigen Aufbaus von Promotoren und "Enhancern" sollte man sich bei der Betrachtung des Transkriptionskomplexes eher auf die einzelnen Module und die sie erkennenden Faktoren beziehen und sich nicht auf die Unterscheidung von Promotoren und "Enhancern" versteifen. Dies ist ohnehin erst möglich, wenn man den Nachweis erbracht hat, daß bestimmte Bereiche der betrachteten Region in ihrer Lage relativ zum Transkriptionsstart veränderbar sind, ohne ihre Funktion einzubüßen. In dieser Arbeit wird deshalb nicht zwischen Promotor und "Enhancer" unterschieden, sondern vereinfachend der Begriff "Promotor" oder "Promotorregion" benutzt.


Zielsetzung der Arbeit

Aufgrund fehlender Ähnlichkeiten zu anderen Genen gibt es bis heute keine Hinweise über die physiologische Funktion des Huntingtin-Proteins. Auch die Klonierung des homologen Gens bei Maus (Lin et al., 1994), Ratte (Schmitt et al., 1995) und Pufferfisch (Baxendale et al., 1995) ermöglicht trotz evolutionärer Konservierung einzelner Genbereiche Rückschlüsse auf deren funktionelle Bedeutung. In dieser Arbeit sollen daher die 5‘-Region des Huntingtin-Gens von Ratte und Mensch isoliert, sequenziert und funktionell charakterisiert werden.

Aus einer vereinzelten Chromosom 4 Cosmidgenbank (Rieß et al., 1994) ist das vollständige Huntingtin-Gen des Menschen isoliert worden. Cosmid 191F1 enthält die ersten beiden Exons und das 5'-Ende des Huntingtin-Gens. Ausgangspunkt für die Isolierung der Promotorregion des Huntingtin-Gens der Ratte ist die Klonierung der entsprechenden cDNA der Ratte (Schmitt et al., 1995). Das 5'-Ende der Ratten-cDNA (RHD10, Position 230 bis 2330) soll zum Hybridisieren zweier genomischer Phagengenbanken und einer genomischen Cosmidbank der Ratte (zur Verfügung gestellt durch Dr. Boulter, La Jolla, Kalifornien) genutzt werden. Auf diese Art und Weise soll ein genomischer Cosmid- oder Phagenklon isoliert werden, von dem wiederum ein geeignetes Restriktionsfragment subkloniert und analysiert werden soll.

Nach Sequenzierung der isolierten Fragmente soll eine computergestützte Analyse Sequenzhomologien und mögliche Transkriptionsfaktorbindestellen aufdecken. Sequenzähnlichkeiten zwischen den Spezies ermöglichen eventuell erste Hinweise auf deren potentielle Funktion.

Weiterhin soll versucht werden, den Transkriptionsstartpunkt des Huntingtin-Gens zu ermitteln. Dazu sollen zunächst Primer-Verlängerungsversuche unter Nutzung verschiedener Primer durchgeführt werden und die Ergebnisse mit S1-Nuklease-Versuchen bestätigt werden.

Die Funktion der klonierten Sequenzen als Promotor soll durch CAT-Reportergenanalysen bestätigt werden. Dabei wird die zu untersuchende Sequenz vor das bakterielle Gen für Chloramphenicol-Acetyltransferase kloniert und anschließend die CAT-Expression in neuronalen und nichtneuronalen Zellinien gemessen. Der Vergleich verschiedener Deletionskonstrukte ermöglicht unter Umständen die Identifikation von positiven und negativen Regulationselementen sowie die Formulierung eines Minimalpromotors, der für eine basale Expression hinreichend ist. Ein Vergleich der Expression in verschiedenen Zelltypen gibt möglicherweise Aufschluß über Promotorbereiche, die die Zelltypspezifität der Expression festlegen.

Mit Hilfe von DNase I Schutzexperimenten sollen Bereiche in den klonierten Sequenzen identifiziert werden, die von DNA-bindenden Proteinen erkannt werden. Die Bindung dieser Proteine macht die DNA für DNase I nicht mehr zugänglich, was zu einem "Fußabdruck" (von engl. "Footprint") dieser Proteine auf der DNA führt.

Mit DNA-Abschnitten, in denen Protein-Bindung über DNase I Schutzexperimente nachgewiesen wurde, sollen außerdem mittels Gelretardationsanalysen Assoziationskinetiken zum Nachweis hochaffiner Bindung von Proteinen an die DNA durchgeführt werden.

Von der funktionellen Charakterisierung der Promotorregion wird ein deutlicher Wissenszuwachs bezüglich der Regulation der Expression des Huntingtin-Gens erwartet. Es ist besonders wichtig, ein Gen und dessen Regulierung für die Entwicklung eines Tiermodells genauestens zu untersuchen, um sicherzustellen, daß das Tiermodell den entsprechenden Verhältnissen beim Menschen möglichst nahe kommt.


Zusammenfassung

Die vorliegende Arbeit ist die erste funktionelle Analyse des Huntingtin-Promotors. Sie ist als vergleichende Charakterisierung des Promotors zwischen Ratte und Mensch geplant und durchgeführt worden und kann aufgrund des erheblichen Arbeitsaufwandes lediglich den Beginn einer detaillierteren Analyse darstellen. Die bisher gewonnenen Erkenntnisse sind im Folgenden zusammengefaßt.

Mittels Durchmusterung zweier genomischer Phagenbanken und einer genomischen Cosmidbank der Ratte konnten 1348 bp der 5‘ regulatorischen Region des Ratten Huntingtin-Gens kloniert und sequenziert werden. Durch Amplifikation von 2256 bp eines Cosmids konnte auch die Promotorregion des menschlichen Huntingtin-Gens kloniert werden.

Aus der Promotorregion des menschlichen Huntingtin-Gens konnte eine genomische Sonde entwickelt werden, die es bei Verdau genomischer DNA mit Pst I ermöglicht, diverse Allele des Huntingtin-Gens mit verschieden langen (CAG)n-Wiederholungen über Southern Blot Analyse darzustellen. Durch diesen einfachen Test konnte die Sicherheit der Morbus Huntington Gendiagnostik bei vermeintlicher Homozygotie der getesteten Person verbessert werden.

Sequenzanalysen und Vergleiche mit den Promotor-Sequenzen von Ratte, Mensch und Maus (Lin et al. 1995) lieferten eine hoch konservierte Region von 150 bp (Pos. -56 bis -206 bezüglich der Sequenz der Ratte). Die Sequenzen sind jeweils GC-reich, verfügen aber nicht über eine TATA- oder CAAT-Box. Computeranalysen lieferten eine Reihe von möglichen Transkriptionsfaktorbindestellen, die in allen drei Spezies konserviert sind.

Mittels Primer-Verlängerungsversuchen und S1-Nuklease-Tests gelang es nicht, den Transkriptionsstartpunkt des Ratten Huntingtin-Gens sicher zu bestimmen. Jedoch gibt es Hinweise auf die Existenz mehrerer möglicher Transkriptionsstartpunkte in der hoch konservierten Region des Huntingtin-Gens.

CAT-Reportergenanalysen lieferten den Nachweis, daß sowohl beim menschlichen Promotor, als auch beim Promotor der Ratte die vollständige hoch konservierte Region unbedingt für eine Grundaktivität des Promotors erforderlich ist. Das Vorhandensein weiterer 5‘-Sequenzen vermag die Aktivität in neuronalen und nichtneuronalen Zellen noch einmal zu steigern, jedoch konnten bei keinem der benutzten Konstrukte signifikante Unterschiede der Expressionsstärke zwischen neuronalen und nichtneuronalen Zellen festgestellt werden.

Über DNase I Schutzexperimente war es bei beiden Spezies möglich, Sequenzen zu identifizieren, die von Kernproteinen gebunden werden.

Gelretardationsanalysen lieferten über spezifische Kompetition und Bestimmung von Gleichgewichtskonstanten den Nachweis, daß Restriktionsfragmente mit identifizierten Proteinbindestellen tatsächlich mit hoher Affinität von Kernproteinen aus neuronalen und nichtneuronalen Zellen gebunden werden. Vergleiche mit anderen Kompetitor-Fragmenten zeigten, daß die Bindung in vielen Fällen auch sequenzspezifisch stattfindet.

Mit Hilfe transgener Mäuse mit Fusionskonstrukten aus dem menschlichen Huntingtin-Promotor und dem bakteriellen LacZ-Reportergen soll die Frage geklärt werden, ob der gesamte für die Entwicklungs- und Gewebespezifität der Expression notwendige Bereich kloniert werden konnte und welche Bedeutung der aus der konservierten Region bestehende Minimalpromotor hat. In Zellkultur konnte bewiesen werden, daß die hergestellten Konstrukte tatsächlich funktionieren. Erste transgene Mäuse mit der hoch konservierten Region des Huntingtin-Promotors konnten bereits erfolgreich erzeugt werden und müssen noch zur Etablierung einer stabilen Linie mit normalen Tieren desselben Stammes rückgekreuzt und anschließend analysiert werden.

Diese Studien zur funktionellen Charakterisierung des Huntingtin-Promotors sind wichtig zum Verständnis der biologischen Grundlagen der Genregulation und liefern wertvolle Informationen für die Entwicklung von Tiermodellen für Morbus Huntington.